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過氧化氫酶(Catalase,CAT)檢測
時間:2024-06-05
   過氧化氫酶(Catalase,CAT)是一種普遍存在于幾乎所有生物體內的一種抗氧化酶,主要作用是催化過氧化氫分解為水和氧氣,清除體內的過氧化氫,從而使細胞免于遭受H2O2的毒害,是生物防御體系的關鍵酶之一,為機體提供了抗氧化防御機理。
   過氧化氫酶(catalase,CAT)普遍存在于植物組織中,是重要的保護酶之一,其作用是清除代謝中產生的H2O2,以避免H2O2積累對細胞的氧化破壞作用,因而其活性的高低與植物的抗逆性有關。
   CAT參與的脅迫反應 在植物遭受生物和理化因子傷害時,膜上受體接受并傳遞脅迫信號,引發質膜和細胞器的氧化猝發,產生ROS,ROS在傳遞和放大信號過程中會改變離子的分布和啟動核基因的表達,從而使植物耐受各種脅迫。同時CAT通過清除作用使ROS保持一定的濃度范圍,CAT的這種保護機制,也體現在植物的各種抗逆反應中。 1.1 參與抗病反應 近年來的研究發現CAT參與了植物的抗病反應,例如在CAT基因缺失的煙草中, H2O2含量升高 ,并產生類似于凋亡的細胞死亡,植物的抗病因子水楊酸 (SA) 則能夠抑 制CAT的活性,產生過多的ROS,從而引起系統性防衛反應,或者在植物受到病原微生物侵染的氧化迸發初期階段,CAT分解H2O2,生成氧分子,觸發了苯甲酸生成SA,導致SAR反應發生,如轉玉米CAT2基因的煙草引起更為嚴重的超敏反應,從而有效地控制細菌感染。
   植物的另一種抗病信號因子茉莉酸甲酯 (MJ) 存在于非依賴 SA 的防衛反應中,但和SA具有協同效應,例如SA可以增強MJ的對氧化脅迫標志 Ao PR102GUS 的表達 ,CAT卻起到了抑 制作用,因此H2O2是兩條防衛途徑的中間效應子 ,通過CAT等抗氧化酶的協同作用實現信號轉導 ,從而在轉錄水平上啟動和調控一些特殊防衛基因的表達 ,或者通過破壞亞細胞結構成分而導致細胞功能的喪失 ,進而產生超敏反應。 1.2 水分脅迫 一些非生物脅迫 ,會使生物體內CAT的表達量發生變化。有人提出CAT活性可作為植物耐旱性鑒定的重要生理指標之一。例如高粱以CAT為主要抗氧化酶,具有較強的抗旱能力和傷害修復及超補償能力,水分脅迫下高粱CAT活性顯著增加。在玉米中的研究也發現其抗旱性與水分脅迫下CAT等保護酶活性呈顯著正相關,抗旱性強的玉米品種,其 SOD、CAT、GPX等保護酶活性較高。 1.3 鹽脅迫 在許多植物中發現CAT和鹽脅迫有關,例如轉Escherichia coli kat E基因的水稻增強了對鹽脅迫的耐性, 植株葉片在受到冷和高鹽脅迫時, FaCat1表達量顯著增加,特別是在處理后的2h和4h時 ,其表達量達到z大。在進一步研究鹽脅迫和恢復過程中的機制時發現,小麥的含水狀況及K+ / Na+比率和CAT等抗氧化酶活性呈正相關,而和膜結構損害情況相反,外施低濃度CO的供體血色素能夠逆轉NaCl所致的小麥幼苗細胞膜損害、脂質過氧化物產生等氧化脅迫,這也歸因于POD、SOD、APX和CAT抗氧化酶對脂類過氧反應產物增加所起到的阻止作用,并且能夠保護鹽脅迫所誘導的葉綠素損壞。 1.4 臭氧和光脅迫 臭氧和光因子存在著一定的關系且都和CAT有關。臭氧和缺乏CAT的植株都能觸發JA的產生,增加GSH1和GSH2的轉錄活性。臭氧在誘導高活性CAT和POX、SOD的同時,激活了葉黃素循環庫,降低葉綠素含量,從而保護光合作用機構;而在光呼吸狀態下,低活性CAT的轉基因煙草中H2O2的動態平衡遭到破壞,誘導了非生物脅迫的細胞死亡。 1.5 溫度脅迫冷和熱擊都能夠引起 CA T的表達量發生改變。黃瓜葉片CAT活性和耐冷力表現一致 ,以及表達小麥CAT基因的水稻提高對低溫脅迫忍耐都證實了CAT和冷脅迫存在著一定的關系。但是,H2O2聚集和冷忍耐并非一致,因為CAT活性在SA處理過程中并未發現下降,說明SA誘導的冷忍耐并不一定和CAT活性的降低有關。即在冷脅迫中,SA和H2O2信號因子不是一種上下游的關系,這和植物的抗病反應有所區別,可能CAT和SA誘導的低溫忍耐存在著不同的作用機制。
   作用機制 不同的非生物脅迫可以激發相似的信號途徑。H2O2、NO和ABA都能夠誘導氣孔關閉, 并且ABA誘導NO的產生和氣孔的關閉依賴于H2O2的生成,通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察蠶豆氣孔開度的大小時 ,也發現外施CAT可抑 制ABA誘導保衛細胞NO的產生;利用同樣的技術,發現定位在人參不定根中的NO能夠減緩銅離子對植物造成的傷害 ,其機制可能也是隨著H2O2的增加,啟動了CAT等抗氧化酶活性。
   在分析玉米的過氧化氫酶基因 CA T1~ CA T3的啟動子結構時發現 ,其上都有許多與信號轉導有關的轉錄因子的結合位點, 如 NF2kB、ARE、AP21和ABRE。由此提出玉米施用外源植物激素ABA或者受到滲透脅迫時的可能信號傳導途徑,這些外界因素會誘導ROS分子的產生,z終激活轉錄因子ARE、ABRE22、CBF1和CBF2,從而導致了抗氧化基因Cat1的表達來平衡H2O2的含量。但脅迫作用機制會隨環境中脅迫因子的不同而存在著交叉和分歧,從而構成了復雜的信號網絡(圖 1)。CAT可能是這些途徑中關鍵調控蛋白之一,對它和與之相關蛋白的研究有助于全 面了解H2O2作為第 二信使的作用機制。
   測定原理: H2O2 在 240nm 下有特征吸收峰,CAT 能夠分解H2O2,使反應溶液240nm 下的吸光度隨反應時間而下降, 根據吸光度的變化率可計算出CAT 活性。
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