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了解果蔬組織中淀粉酶的特點(diǎn)，學(xué)習(xí)淀粉酶活性的測(cè)定原理和方法。
二、基本原理
果蔬組織中的淀粉可在淀粉酶作用下轉(zhuǎn)化形成還原糖。淀粉酶對(duì)淀粉的分解作用是生物體利用淀粉進(jìn)行碳水化合物代謝的初級(jí)反應(yīng)。
淀粉酶（Amylase）包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶，特別是萌發(fā)后的禾谷類種子淀粉酶活性z強(qiáng)。不同來源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。重要的淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。其中，α-淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，即作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖、麥芽三糖、寡聚葡萄糖、α-j限糊精等還原糖，同時(shí)使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶。α-淀粉酶比較耐熱但不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化。Ca2+卻能使α-淀粉酶活化和穩(wěn)定。β-淀粉酶從淀粉的非還原端作用于α-1,4-糖苷鍵，每次切下一分子麥芽糖，遇到支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵時(shí)停止，生成β-j限糊精。β-淀粉酶又被稱為糖化酶，它是一種巰基酶，不需要Ca2+及Cl-等輔助因子。與α-淀粉酶相反，β-淀粉酶不耐熱但卻耐酸，在70 ℃保溫15 min可使其鈍化。根據(jù)它們的這種特性，鈍化其中之一，就可測(cè)出另一個(gè)的活性。葡萄糖淀粉酶則從淀粉的非還原端每次切下一個(gè)葡萄糖。
淀粉酶催化產(chǎn)生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活性的大小與生成的還原糖的量成正比。因此，可以用麥芽糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用比色法測(cè)定淀粉水解生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的還原糖的量表示酶活性。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同時(shí)存在。本實(shí)驗(yàn)中先測(cè)定（α+β）淀粉酶總活性，然后在70 ℃加熱15 min，鈍化β-淀粉酶，測(cè)出α-淀粉酶活性。再與總活性（α+β）相比較，求出β-淀粉酶的活性。
三、材料、儀器及試劑
（一）材料
馬鈴薯、香蕉、芒果等。
（二）儀器及用具
電子天平、分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋（40 ℃、70 ℃、100 ℃）、具塞刻度試管（20 mL）、移液器或刻度吸管、容量瓶、研缽、離心管、試管。
（三）試劑
1．標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1 mg/mL）
j確稱取100 mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100 mL。
2．3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑
（1）配制500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液；
（2）配制262 mL 的2 mol/L NaOH溶液；
（3）稱取6.3 g的3,5-二硝基水楊酸；
（4）稱取5.0 g結(jié)晶酚；
（5）稱取5.0 g亞硫酸鈉；
（6）將（2）、（3）、（4）、（5）各成分加入到（1）中，攪拌，使之溶解。待冷卻后，轉(zhuǎn)入到1 000 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容至刻度，貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞，勿使CO2 進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。
3．100 mmol/L、pH 5.6的檸檬酸緩沖液
母液A（200 mmol/L檸檬酸）：稱取42.03 g C6H8O7·H2O2，用蒸餾水溶解、定容至1 000 mL。
母液B（200 mmol/L檸檬酸鈉）：稱取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O2，用蒸餾水溶解、定容至1 000 mL。
取27.5mL 母液A與72.5 mL 母液B，混勻，調(diào)節(jié)pH至5.6，用蒸餾水稀釋至200 mL，即為100 mmol/L、pH 5.6的檸檬酸緩沖液。
4．1%淀粉溶液
稱取1 g可溶性淀粉溶于100 mL 100 mmol/L、pH5.6的檸檬酸緩沖液中。
（一）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取7支具塞刻度試管，編號(hào)，按表13加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻，加蒸餾水至20 mL。以0號(hào)管作為空白調(diào)零，在波長(zhǎng)540 nm處比色測(cè)定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。
表13.淀粉酶活性測(cè)定繪制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑加入量
（二）酶液制備
稱取10.0 g果蔬組織樣品，置于研缽中，加10 mL蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，混合，在室溫（20 ℃）下放置提取20 min，每隔數(shù)分鐘搖動(dòng)一次。然后于8 000 rpm離心20 min，收集上清液，轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶提取液，用于α-淀粉酶活性和淀粉酶總活性的測(cè)定。
（三）活性測(cè)定
取6支具塞刻度試管，編號(hào)，按表14進(jìn)行操作。
表14.淀粉酶活性測(cè)定過程
加入DNS試劑后，搖勻各試管，置沸水浴中煮沸5 min，取出后迅速冷卻，加蒸餾水至20 mL，搖勻。按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的方法，在540 nm波長(zhǎng)下比色，記錄測(cè)定結(jié)果。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算
1．將測(cè)定的數(shù)據(jù)填入下表
2．計(jì)算結(jié)果
用I-2、I-3吸光度平均值與I-1吸光度值之差，II-2、II-3吸光度平均值與II-1吸光度值之差，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖量（mg），計(jì)算α-淀粉酶的活性和淀粉酶總活性，然后再計(jì)算出β-淀粉酶活性。淀粉酶活性以每分鐘每克鮮重果蔬樣品中酶催化作用下產(chǎn)生麥芽糖毫克數(shù)表示，即mg·min-1·g-1 FW。
β-淀粉酶活性 (mg·min-1·g-1 FW) = 淀粉酶總活性－α-淀粉酶活性
式中：
Cα——查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量，mg；
CT——查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得（α+β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量，mg；
V——淀粉酶提取液體積(α-淀粉酶為50 mL)，mL；
VⅠ——測(cè)定α-淀粉酶時(shí)吸取酶提取液的體積，mL；
VⅡ——測(cè)定總（α+β）淀粉酶時(shí)吸取酶提取液的體積，mL；
t ——酶作用反應(yīng)時(shí)間，min；
W ——樣品重量，g。
六、注意事項(xiàng)
1．測(cè)定淀粉酶總活性時(shí)有時(shí)需要稀釋。樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數(shù)可根據(jù)不同材料酶活性的大小而定。
2．DNS試劑是強(qiáng)堿性試劑，在淀粉原酶液和稀釋液中分別先加入DNS試劑（I-1、II-1號(hào)試管），可以鈍化酶活性，作為空白對(duì)照。
3．為了確保酶促反應(yīng)時(shí)間的準(zhǔn)確性，在進(jìn)行保溫這一步驟時(shí)，可以將各試管每隔一定時(shí)間依次放入恒溫水浴，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，到達(dá)5min 時(shí)取出試管，立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應(yīng)，以便盡量減小因各試管保溫時(shí)間不同而引起的誤差。
4．同時(shí)恒溫水浴溫度變化應(yīng)不超過±0.5℃。酶反應(yīng)需要適當(dāng)?shù)臏囟龋挥性谝欢ǖ臏囟葪l件下才表現(xiàn)出z大活性，40℃是淀粉酶的z適溫度，所以應(yīng)將酶液和底物（淀粉液）先分別保溫至z適溫度，然后進(jìn)行酶反應(yīng)，這樣才能使測(cè)得的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。
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